疾病监测

作者：张传宇,扎西,曹轩烨,刘祎,刘倩,李玲雯,史艳文,王宇萌,刘国宪,李伟

关键词：鼠疫耶尔森菌, 簇状规则间隔短回文重复序列, 多酶恒温核酸快速扩增

目的 建立多酶等温快速扩增（MIRA）结合成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas12a核酸检测方法检测鼠疫耶尔森菌，评价方法的灵敏性、特异性，评价方法对鼠疫临床患者和动物鼠疫标本的适用性。方法选择pla和caf1两个靶基因，建立MIRA-CRISPR检测方法。其中，caf1基因位于pMT1质粒上，具有高度特异性；而针对pla基因在近缘菌中存在同源序列的问题，利用鼠疫耶尔森菌pla基因特异性核酸位点作为引物3'端的策略来保障pla基因检测鼠疫菌的特异性。 通过梯度配比法对该方法进行体积比优化，采用阳性质粒模板评估方法的敏感性，使用包含了鼠疫耶尔森菌近缘菌的非鼠疫耶尔森菌DNA模板评估方法的特异性。 最后通过检测6例临床确诊鼠疫患者的血液或淋巴液样本及6份自然疫源地动物肝脏样本，评价该方法的适用性。结果MIRA-CRISPR方法可在30 min内完成检测。 当MIRA与CRISPR体系体积比为1∶2时，检测灵敏度达到最优，该方法对阳性质粒模板的检测限为9拷贝（caf1）和2拷贝（pla）。特异性实验表明，该方法能有效区分鼠疫耶尔森菌与其近缘菌株。 经实际鼠疫阳性样本和阴性对照验证，所有临床样本（6/6）和动物样本（6/6）均被准确检出，展现出良好的实用性能。结论本研究发展的MIRA-CRISPR 具有高灵敏度和高特异性，因此适用于人间鼠疫和动物间鼠疫的检测，尤其是在检测目标DNA含量较低的样本中具有显著优势。

来源：2025年第5期

《疾病监测》期刊编辑部

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